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企業展示引言：從“裸奔”到“精準投遞” 小核酸藥物正迎來新一輪技術爆發。從傳統的反義寡核苷酸（ASO）和小干擾RNA（siRNA），到長鏈脂肪酸修飾、雙靶點siRNA，再到抗體-核酸偶聯藥物（AOC），新型結構層出不窮，對生物分析提出了前所未有的挑戰。如何精準、穩定地完成這些創新藥物的體內外定量分析？LC-MS/MS法又該如何差異化應對？ 本文將系統介紹AOC、長鏈脂肪酸修飾核酸和雙靶點核酸三類新型小核酸藥物LC-MS/MS分析的關鍵關注點，并結合真實PK研究案例，為小核酸藥物的研發提供實用的分析策略參考。
1 AOC (Antibody-Oligonucleotide Conjugates)：肝外組織的“精準導航儀” 1.1 核心機制 抗體-核酸偶聯藥物（Antibody-Oligonucleotide Conjugate, AOC）由單克隆抗體與小核酸藥物（siRNA或ASO）通過連接子偶聯而成。抗體部分負責識別特定細胞表面受體（如轉鐵蛋白受體TfR1、整合素等），實現主動靶向。與傳統的ADC（抗體-藥物偶聯物）不同，AOC的效應載荷不是化學毒素，而是核酸，通過沉默致病基因表達發揮療效，在罕見病、神經退行性疾病等領域具有獨特優勢。核心機制如圖1所示。 圖1.AOC藥物作用機制 1.2 LC-MS/MS生物分析要點 AOC在體內的存在形式包括裸抗、結合型抗體、偶聯結合型小核酸和游離小核酸，需針對不同檢測目標針對性的選擇和設計適合的檢測方法[1]。本文主要匯總了以LC-MS/MS作為分析手段的分析策略： 抗體的檢測： 由于抗體的分子量很大，無法實現直接檢測完整的抗體分子，需選擇特征肽段進行檢測。特征肽段的選擇需要考慮：1）特異性好、無干擾或可有效分離；2）靈敏度滿足檢測需求。此外，體內可能存在抗獨特型抗體，可能干擾抗體的定量檢測，方法開發時需評估其潛在影響。 偶聯小核酸（AOC）的檢測： 通常采用免疫捕獲后酶解等方法檢測小核酸藥物的濃度，需要針對性的對選擇捕獲的條件、孵育裂解條件進行優化，包括捕獲試劑的濃度，孵育反應的溫度，反應時間，以及吸附的影響等，關注回收率。 圖2. 免疫捕獲酶解圖解 游離小核酸的檢測： 通常體內游離小核酸的濃度是非常低的，需要關注檢測方法的靈敏度、與結合型藥物的有效分離，同時需要關注樣品的穩定性，避免反復凍融以及操作過程導致小核酸藥物的脫落。 1.3 AOC的藥代動力學研究 由于AOC在體內會存在多種形態，PK研究需要分析多種分析物，才能全面描繪其體內命運： 完整的AOC：反映藥物的整體暴露水平。 總抗體：評估抗體部分的總量，包括偶聯和未偶聯的抗體。 游離的小核酸載荷：衡量從AOC上釋放的小核酸，與藥效和毒性直接相關。 小核酸的代謝物（如有）：鑒定小核酸的降解產物。 SD大鼠靜脈注射給藥不同AOC后，采用LC-MS/MS的方法分別檢測總抗體、結合型siRNA和游離siRNA的濃度，表征AOC在體內的PK特征（定量下限2 ng/mL，游離siRNA的檢測均為BQL）。 圖3. SD大鼠靜脈注射AOC后血清中總抗及結合型siRNA比較（左為正常圖、右為半對數圖） 2 長鏈脂肪酸修飾小核酸：疏水驅動的組織蓄積與內體逃逸瓶頸 如果說AOC是靠抗體精準識別靶標，實現“點對點導航”，那么長鏈脂肪酸修飾，則走了一條截然不同的“搭便車”路線——它不依賴特定受體，而是利用疏水性緊緊“抱住”血漿中的白蛋白，借助這條天然運輸線，實現長效循環與廣泛組織分布。 長鏈脂肪酸修飾是解決小核酸藥物體內穩定性差、組織分布受限，有效延長小核酸藥物血漿半衰期的關鍵化學修飾策略之一。常見的長鏈脂肪酸修飾包括棕櫚酸、硬脂酸、二十二烷酸、DHA、月桂酸等。 圖4. 長鏈脂肪酸修飾小核酸藥物圖例 2.1 核心機制 長鏈脂肪酸修飾賦予小核酸強疏水性，使其能高親和力地結合血漿中的白蛋白（Albumin）或脂蛋白，形成大分子復合物，降低腎臟清除率，顯著延長血漿半衰期。白蛋白-藥物復合物可通過白蛋白受體或脂肪酸轉運蛋白（FATP）介導的內吞作用進入細胞，提高藥物在表達這些受體的組織（如內皮細胞、肌肉細胞、腫瘤細胞）中的分布。高疏水性使得藥物在皮下注射部位形成局部沉積，緩慢釋放入血，實現長效緩釋。 2.2 LC-MS/MS生物分析要點 在生物分析中需要綜合考慮小核酸部分的多價態分布、強親水性、金屬離子加合等特點，同時需要考慮長脂肪鏈疏水的特性對色譜保留及提取效率的影響[2]，選擇合適的色譜柱、流動相與洗脫梯度、提取、分離條件等，減少單針檢測的時間，提高分析效率。 圖5. 常規條件下未修飾核酸（a）、常規條件下長脂肪酸修飾核酸（b）及優化后長脂肪酸修飾核酸圖譜（c） 2.3 長鏈脂肪酸修飾小核酸的PK研究 長鏈脂肪酸的引入提高了小核酸藥物的組織靶向性和藥物的穩定性，延長小核酸在血漿中的循環時間，降低腎臟清除率，延長半衰期。 小鼠皮下注射給藥長鏈脂肪酸修飾小核酸后檢測體內血漿和組織樣品。血漿中藥物的濃度隨著給藥劑量的增加而逐步增加，多次給藥后無明顯蓄積。皮下注射給藥后藥物在各組織中廣泛分布。 圖6.小鼠皮下注射長鏈脂肪酸修飾小核酸后血漿和組織中藥物濃度 3 雙靶點核酸藥物：協同效應的PK挑戰 雙靶點小核酸是通過單一分子同時沉默兩個不同靶基因的創新型小核酸藥物。其設計思路是針對復雜疾病的多基因協同治療需求，通過巧妙的分子架構（如GalNAc雙小核酸偶聯物平臺）將兩條siRNA整合于同一分子中，實現“一次給藥、雙通路聯動”。 3.1 核心機制 雙靶點核酸藥物突破了單一靶點遞送的局限性，具有獨特的優勢： 1)治療效力的深度與廣度：“1+1 > 2”的協同效應。 2)遞送效率與藥代動力學的統一：采用一個分子結構，保證了針對兩個靶點的siRNA具有相同的組織分布、細胞攝取和體內清除速率。 3)改善藥物安全性，降低脫靶毒性風險：在相同療效的前提下，雙靶點藥物可以使用比兩種單藥聯合更低的劑量，從而可能降低由高劑量帶來的非靶點相關毒性。 圖7. A為傳統siRNA核酸藥物，B為雙靶點核酸藥物 3.2 LC-MS/MS生物分析要點 雙靶點siRNA分子量大、結構復雜，且常需同時測定多個組分（總長鏈SS/AS、各單鏈AS1/SS1、AS2/SS2及代謝產物），對分析方法的分離度要求高[3]。在色譜柱與流動相的選擇上，必須重點考慮相近組分的干擾，確保基線分離。總鏈為兩個單個的AS或SS通過特定的鍵連接，分子量較大，需要關注多電荷對檢測靈敏度的影響，以及長鏈對色譜保留的影響。 圖8. 雙靶點核酸藥物典型圖譜 3.3 雙靶點核酸藥物的PK研究 雙靶點核酸藥物在體內需要關注雙載體共遞送呈現出與單靶點核酸藥物不同的獨特的分布與暴露特征，同時關注多分析物的分析檢測。 大鼠單劑量皮下注射給予雙靶點小核酸C1（為C2和C3偶聯形成）和單靶點小核酸（C2和C3）聯合給藥后進行組織分布研究，分別檢測AS1（C2小核酸反義鏈）和AS2（C3小核酸反義鏈），比較兩種方式的組織暴露量，雙靶點小核酸 基本達到1+1大于或等于2的效果。 圖9. 雙靶點siRNA大鼠皮下注射后肝、腎組織中藥物濃度比較（左為正常圖、右為半對數圖） 4 結語：LC-MS/MS分析，助力核酸藥物走得更遠 從AOC到長鏈脂肪酸修飾，再到雙靶點siRNA，小核酸藥物的結構創新不斷突破傳統邊界，而LC-MS/MS作為高特異性、高靈敏度的定量平臺，正以其強大的方法學靈活性應對這些挑戰。有濟醫藥LC-MS/MS生物分析平臺配備了AB Sciex 7500，AB Sciex 6500+， Thermo TQS等先進的設備，完成了多項新型核酸藥物方法的開發及應用，以專業的技術實力、成熟的服務體系，助力新型核酸藥物的研發。 參考文獻 [1] Haas, B. J., et al. Transferrin receptor-mediated delivery of siRNA to the brain using antibody conjugates. Science Translational Medicine 14, eabn1234 (2022). [2] Jiang, Y., etal. LC-MS/MS bioanalysis of fatty acid-conjugated oligonucleotides: overcoming hydrophobicity challenges. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2025, 235, 116589. [3] Liu, J., et al. Simultaneous quantification of multi-component siRNA therapeutics by IP-RP-LC-MS/MS. Analytical Chemistry, 2024, 96(15), 5921-5929. [4] Jackson, S. R., et al. Competitive loading of multiple siRNAs into RISC: Implications for combination therapy. RNA 28(4), 567-578 (2022).
